Laboratoire de miscroscopie confocale et cytométrie
Fonction de l'infrastructure
La cytométrie est une technique qui vise la quantification et la mesure de cellules d’un échantillon donné. Sous sa forme la plus simple et la plus ancienne, un protocole de cytométrie nécessitait l’utilisation d’un microscope optique, à partir duquel un utilisateur pouvait compter manuellement des cellules colorées préalablement. Quoi que la cytométrie en flux s’inspire de ce principe, elle repose sur de nombreuses avancées technologiques qui permettent à la fois l’automatisation du processus ainsi que l’augmentation de sa précision.
Le cytomètre en flux mesure l’interaction entre une ou plusieurs sources de lumières (généralement des lasers) et un flux liquidien qui canalise et achemine les cellules en file. Lors du passage d’une cellule devant le laser, la lumière émise sera diffractée en fonction de la taille et de la morphologie de la cellule, produisant divers signaux qui sont amplifiés et mesurés par le système optique, composé de miroirs dichroïques et de détecteurs de lumière, puis convertit en signaux électriques qui pourront être analysés par l’ordinateur lié au système. Certains protocoles comprennent également l’ajout d’anticorps fluorochromes spécifiques à un marqueur d’intérêt, qui seront excités par le passage au laser et émettrons des photons qui pourront également être capturés par le système optique.
Cytomètre en flux FACSMelody de BD qui possède une fonction de trieur de cellules, sous une hotte à flux laminaire pour permettre les expériences de culture cellulaire stériles
Les données recueillies comprennent donc la lumière diffuse à petits angles (forward scatter, qui est corrélé à la taille de la cellule), la lumière diffuse à 90 degrés (side scatter, qui varie selon la granularité des cellules ainsi que ses composantes internes) et la fluorescence émise (autofluorescence de la cellule ainsi que celle provenant de fluorochromes excités). Ces résultats sont imagés sous la forme d’histogrammes multi ou mono-paramétriques décrivant l’intensité de la lumière capturée pour divers paramètres, qui pourront être utilisés pour identifier les types de cellules dans l’échantillon, les contaminants et divers autres facteurs.
Quoi que la majorité des cytomètres en flux sur le marché sont utilisés pour n’effectuer qu’un seul passage, l’échantillon étant ensuite jeté, certains modèles ont une fonctionnalité de triage de cellules, permettant d’isoler des cellules en fonction des signaux émis pour regrouper les populations cellulaires différentes dans des contenants séparés. Le flux, une fois passé par le système optique, est brisé par une buse qui emmet vibrations à une longueur d’onde spécifique permettant de former des gouttelettes qui ne contiennent qu’une seule cellule. Au moment du bris, les gouttelettes obtiennent une charge électromagnétique en fonction de l’identité interprétée par l’ordinateur, via un anneau de charge électromagnétique positionné à l’ouverture de la buse. Cette charge permet ensuite le tri par un courant magnétique qui fera dévier la trajectoire de la particule en fonction de sa charge, permettant sa collecte dans le contenant approprié. Les cellules ainsi récoltées peuvent ensuite être réutilisées dans des expériences subséquentes ou remises en culture.
Un microscope confocal diffère d’un microscope optique par sa production d’une représentation tri-dimensionnelle virtuelle de l’objet étudié, plutôt qu’un agrandissement de l’objet généré par l’utilisation de lentilles et observable à l’oeil nu.
Son fonctionnement a été imaginé en cherchant à nullifier certains des problèmes des microscopes optiques traditionnels, tel qu’une difficulté à obtenir une image nette lors de la visualisation d’objets à relief important ou très épais, ces derniers sortant du point focal du microscope, problème qui est amplifié plus le grossissement est important. L’éclairage d’un microscope optique illumine aussi la totalité de la cible observée, ce qui est problématique pour certaines expériences de fluorescence, où les signaux hors du plan focal flous peuvent venir réduire la clarté de l’image et des signaux provenant de l’échantillon.
Ces problématiques sont évitées par deux additions importantes: l’éclairage provient d’un laser, qui illumine point-par-point la cible, et la lumière réfléchie doit passer par un sténopé avant d’être capturée par le détecteur, ce qui bloque la lumière ou fluorescence provenant hors du champ focal de la lentille. Les signaux sont ensuite amplifiés par des photomultiplicateurs et emmagasinés sous forme de signal électrique témoignant de l’intensité du point. Un nouveau point est ensuite illuminé, et ce, jusqu’à ce que toute la section délimitée ait été testée. Une image est ensuite produite en fonction des signaux captés tout au long du processus, représentation visuelle des signaux lumineux captés pour chaque point à une hauteur spécifique de la cible (soit le point focal), recomposée par l’ordinateur.
Afin de produire un modèle tri-dimensionel, un déplacement de l’objet sur l’axe des Z est nécessaire afin de faire entrer une nouvelle tranche de la cible dans le plan focal des lentilles. Une superposition des images permet ensuite d’obtenir une représentation en 3D de la cible, où chaque image illustre une mince couche de l’objet réel étudié. Des photos peuvent être prisent aussi après des laps de temps successifs, permettant la production d’une vidéo qui illustre les changements dans un modèle vivant avec le temps.
Microscope confocal LSM 780 de Zeiss
Exemple de visualisation par laps de temps au microscope confocal. Deux vacuoles parasitrophes communales fusionnent pour en produire une plus grande. Modèle utilisant des macrophages dérivés de la moelle, obtenues à partir de souris transgéniques Life-Act qui permettent de visualiser l’actine polymérisée. Ces cellules sont infectés par des virus Leishmania Amazonensis GFP.
Vidéo produite par Christine Matte.
Le laboratoire et l'Infectiopôle
Cette infrastructure de recherche favorise l’avancée d’une variété de projets qui utilisent des modèles cellulaires. Les fonctions du cytomètre en flux permettent non seulement d’identifier les composantes d’une population cellulaire, mais aussi de les trier en fonctions de caractéristiques propres à votre projet de recherche. Le microscope confocal permet également la visualisation des cellules dans divers contextes.
Instruments
- Un trieur à cellules BD FACSMelody hautement automatisé et facile à apprendre permettant d'isoler jusqu'à quatre populations cellulaires différentes.
- Un microscope confocal LSM 780 de Zeiss.
Personnes-ressources
Modalités d’utilisation et tarification
- jessy.tremblay@inrs.ca
- +1 (450) 687-5010, poste 4314